T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligase [LGA-111]

가격표

DNA 연결 효소

품명 Code No. 포장 저장 온도 설명서 사양 SDS 법규제 ※
품명 T4 DNA Ligase Code No.LGA-111 포장 400U×1개 저장 온도 -20℃ 설명서 사양 SDS 법규제 ※ 없음
품명 T4 DNA Ligase Code No.LGA-111X5 포장 (400U×1개)×5 저장 온도 -20℃ 설명서 사양 SDS 법규제 ※ 없음

용도

●DNA 단편이나 닉의 연결

목적 유전자의 벡터에의 삽입이나, DNA에의 링커 부가 등의 반응에 이용할 수 있습니다.

설명

T4 DNA Ligase는, 인접한 DNA의 5'단의 인산기와 3'단의 수산기를 포스포디에스테르 결합에 의해 연결하는 효소로, Mg2 + 와 rATP를 요구합니다.
평활 말단 및 돌출 말단의 2본쇄 DNA, 또는 닉이 들어간 2본쇄 DNA에 작용하지만, RNA와 RNA나, RNA와 DNA에는 거의 작용하지 않습니다.
또한, 라이게이션 반응의 속도는 DNA 말단의 형상 및 염기서열에 따라 다릅니다.

특징

원리

실시예

DNA 말단 형상에 의한 반응성 비교

DNA 말단 모양에 따른 반응성 비교"" />

확대 +

다양한 제한 효소에 의해 절단한 DNA 단편을 이용해 DNA의 말단 형상에 의한 T4 DNA Ligase의 반응성의 차이를 검토했습니다.
5' 말단 농도를 0.1μM으로 하고, 다양한 효소량으로 16℃에서 1hr.반응시킨 후, 전기영동 해석한 결과를 A에 나타냈다. 또한 마찬가지로 5'말단 농도를 0.1μM( Hae III는 1.0μM)로 하고, 16℃에서 다양한 시간 반응시킨 후, 전기영동 해석한 결과를 B에 나타냈다.
결과로부터, 평활 말단의 DNA는, 돌출 말단의 DNA에 비해, 라이게이션 효율이 낮은 것을 알 수 있습니다. T4 DNA Ligase의 평활 말단 DNA에 대한 Km값은 돌출 말단의 경우에 비해 약 100배 높기 때문에 평활 말단 DNA의 Ligation 반응에서는 DNA 농도와 Ligase의 효소량을 높게 설정해야 합니다.

기타 실시예

참고 문헌

1) NE Murray et al., J. Mol. Biol. , 132 : 493 (1979)
2) B. Weiss et al., J. Biol. Chem. , 243 : 4543 (1968)

제품 내용

T4 DNA Ligase (1-5U / μL)
10×버퍼 * [LGA-1B]
*rATP는 포함되지 않습니다. rATP [Code No.ATP-111]를 사용할 수 있습니다.

모양:
20mM Tris-HCl (pH7.6)
1mM EDTA
60mM KCl
5mM DTT
50% Glycerol

10×Buffer [Code No. LGA-1B] 조성:
660mM Tris-HCl (pH7.6)
100mM DTT
66mM MgCl 2

활동 정의:
ATP-PPi 교환 반응에 있어서 37℃, pH 7.6에서 20분에 1nmole의 32 PPi를 교환하는 효소량을 1U로 합니다.
본 효소 1U(Weiss Unit)는 125Ligation Unit에 상당합니다.

기원:
E.coli 재조합체

순도:
본 효소 12.5U와 1μg의 λDNA/ Hin dⅢ분해물을 50μL 반응계에서 16℃에서 16시간 반응시켜도 DNA의 전기영동 패턴은 변화하지 않습니다.
본 효소와 1㎍의 E.coli [ 3H ]-DNA를 16℃에서 반응시킨 경우, 산 가용성 분획에 유리되는 방사 활성은 1시간에 1U당 0.01% 이하입니다.
본 효소와 1㎍의 5'단에 32P 를 라벨한 λDNA/ Hind dⅢ분해물을 16℃에서 반응시킨 경우, 산 가용성 분획에 유리되는 방사 활성은 1시간에 1U당 0.01% 이하입니다.
본 효소 12.5U와 1μg의 super coiled φx174 DNA를 50μL 반응계에서 16℃에서 16시간 반응시켜도 DNA의 전기영동 패턴은 변화하지 않습니다.

기본 반응 조건

<벡터에의 라이게이션>
멸균 증류수 XμL
벡터 DNA 0.05-0.5μg
인서트 DNA 벡터의 3배의 몰수
10×버퍼 2μL
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 0.5-1U (돌출 말단)
1-5U(평활 말단)
Total Volume 20μL

16 ℃, 4-16hr.

<링커 라이게이션>
멸균 증류수 XμL
DNA 0.1-1μg
링커 DNA의 10배의 몰수
10×버퍼 2μL
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 1-5U
Total Volume 20μL

16 ℃, 8-16hr.

*DNA의 농도나 형상, 염기서열, 길이에 따라 효율은 변화합니다.

원포인트 조언

●평활 말단의 라이게이션 평활 말단의 라이게이션은, 돌출 말단에 비해 반응성이 낮은 경향에 있습니다(Km치는, 돌출 말단의 약 100배). 평활 말단에 의한 라이게이션을 실시하는 경우는, DNA 농도를 높게 하고, 사용하는 효소량을 돌출 말단의 2~5배 정도 많이 첨가합니다.


●반응 온도에 대해서 본 효소의 최적 온도는 37℃입니다만, 연결하는 DNA의 말단의 하이브리드화의 효율을 생각해 통상 반응은 16℃에서 실시합니다. 경우에 따라 4℃ ~ 실온에서 반응하는 것도 가능합니다.


●EDTA에 대해서 본 효소는 Mg2+를 요구하기 때문에, Mg2 + 를 킬레이트하는 EDTA는 반응을 저해하는 경우가 있습니다. 고농도의 EDTA를 함유하는 완충액에 DNA를 용해시킨 샘플로 사용하는 경우에는 멸균 증류수 또는 TE 완충액으로 치환한 후 사용하는 것이 좋습니다.


● DNA량에 대해 플라스미드 DNA와 인서트 DNA의 반응은 몰비로 1:3이 되도록 합니다. 코스미드나 파지에의 라이게이션의 경우는 벡터와 인서트의 몰비는 1:1이 되도록 하여 DNA 농도도 높게 설정합니다(0.05~0.1μg/μL 이상).

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품명 Code No. 포장 저장 온도 설명서 사양 SDS 법규제 ※
품명 Competent Quick DH5α Code No.DNA-913F 포장 0.1mL×20개 저장 온도 설명서 사양 SDS 법규제 ※ -80℃, 액체 질소

제품 내용

T4 DNA Ligase (1-5U / μL)
10×버퍼 * [LGA-1B]
*rATP는 포함되지 않습니다. rATP [Code No.ATP-111]를 사용할 수 있습니다.

모양:
20mM Tris-HCl (pH7.6)
1mM EDTA
60mM KCl
5mM DTT
50% Glycerol

10×Buffer [Code No. LGA-1B] 조성:
660mM Tris-HCl (pH7.6)
100mM DTT
66mM MgCl 2

활동 정의:
ATP-PPi 교환 반응에 있어서 37℃, pH 7.6에서 20분에 1nmole의 32 PPi를 교환하는 효소량을 1U로 합니다.
본 효소 1U(Weiss Unit)는 125Ligation Unit에 상당합니다.

기원:
E.coli 재조합체

순도:
본 효소 12.5U와 1μg의 λDNA/ Hin dⅢ분해물을 50μL 반응계에서 16℃에서 16시간 반응시켜도 DNA의 전기영동 패턴은 변화하지 않습니다.
본 효소와 1㎍의 E.coli [ 3H ]-DNA를 16℃에서 반응시킨 경우, 산 가용성 분획에 유리되는 방사 활성은 1시간에 1U당 0.01% 이하입니다.
본 효소와 1㎍의 5'단에 32P 를 라벨한 λDNA/ Hind dⅢ분해물을 16℃에서 반응시킨 경우, 산 가용성 분획에 유리되는 방사 활성은 1시간에 1U당 0.01% 이하입니다.
본 효소 12.5U와 1μg의 super coiled φx174 DNA를 50μL 반응계에서 16℃에서 16시간 반응시켜도 DNA의 전기영동 패턴은 변화하지 않습니다.

기본 반응 조건

<벡터에의 라이게이션>
멸균 증류수 XμL
벡터 DNA 0.05-0.5μg
인서트 DNA 벡터의 3배의 몰수
10×버퍼 2μL
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 0.5-1U (돌출 말단)
1-5U(평활 말단)
Total Volume 20μL

16 ℃, 4-16hr.

<링커 라이게이션>
멸균 증류수 XμL
DNA 0.1-1μg
링커 DNA의 10배의 몰수
10×버퍼 2μL
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 1-5U
Total Volume 20μL

16 ℃, 8-16hr.

*DNA의 농도나 형상, 염기서열, 길이에 따라 효율은 변화합니다.

원포인트 조언

●평활 말단의 라이게이션 평활 말단의 라이게이션은, 돌출 말단에 비해 반응성이 낮은 경향에 있습니다(Km치는, 돌출 말단의 약 100배). 평활 말단에 의한 라이게이션을 실시하는 경우는, DNA 농도를 높게 하고, 사용하는 효소량을 돌출 말단의 2~5배 정도 많이 첨가합니다.


●반응 온도에 대해서 본 효소의 최적 온도는 37℃입니다만, 연결하는 DNA의 말단의 하이브리드화의 효율을 생각해 통상 반응은 16℃에서 실시합니다. 경우에 따라 4℃ ~ 실온에서 반응하는 것도 가능합니다.


●EDTA에 대해서 본 효소는 Mg2+를 요구하기 때문에, Mg2 + 를 킬레이트하는 EDTA는 반응을 저해하는 경우가 있습니다. 고농도의 EDTA를 함유하는 완충액에 DNA를 용해시킨 샘플로 사용하는 경우에는 멸균 증류수 또는 TE 완충액으로 치환한 후 사용하는 것이 좋습니다.


● DNA량에 대해 플라스미드 DNA와 인서트 DNA의 반응은 몰비로 1:3이 되도록 합니다. 코스미드나 파지에의 라이게이션의 경우는 벡터와 인서트의 몰비는 1:1이 되도록 하여 DNA 농도도 높게 설정합니다(0.05~0.1μg/μL 이상).

※ 법규제에 대해서

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