KOD -Plus-의 높은 정확성을 살린, 인버스 PCR(Inverse PCR)법에 근거하는 부위 특이적 변이 도입 키트입니다.

본 방법에서는 플라스미드 DNA를 주형으로 등 맞추기 위해 설계한 프라이머를 이용하여 플라스미드 전주를 증폭하여 돌연변이 도입을 실시합니다.

●폭넓은 변이 도입에 대응 통상의 변이 도입에 가세해 수 10bp의 삽입(Tag의 삽입)이나 수 100bp의 결실에도 대응 가능합니다. 또, 혼합 염기를 도입한 아미노산점 변이 라이브러리의 제작 등에도 응용 가능합니다.

●확실한 변이 도입 최대 95%의 변이 도입 효율을 얻을 수 있습니다. 또한 PCR 오류로 인한 2nd-site mutation(목표로 하는 돌연변이 이외의 돌연변이)의 가능성을 최소화하고 있습니다. 최대 11kb의 플라스미드로 돌연변이 도입이 확인되었습니다.

●간편한 프로토콜 형질전환까지 3스텝의 간단한 프로토콜로 되어 있습니다. 또한 인산화된 프라이머를 준비할 필요가 없습니다.

이 키트에서는 다음 절차에 따라 돌연변이 도입을 수행합니다.

① Plasmid DNA를 주형으로, 변이를 도입한 프라이머를 이용하여 인버스 PCR(Inverse PCR)을 실시합니다. 결실 돌연변이 체를 얻고 싶다면, 그 결실을 원하는 영역 외부에 프라이머를 설계합니다.

② PCR 산물에 제한효소 Dpn I을 첨가하여 주형 Plasmid를 소화합니다.
( Dpn I은 인식 사이트 (GATC)의 아데닌이 메틸화 될 때만 절단을 수행하므로 일반적인 Dam 메틸라제 (+)의 대장균 균주 (JM109 및 DH5α 등)에서 제조 한 주형 플라스미드 는 메틸화되어 있기 때문에 Dpn I에 의해 절단되어 단편화됩니다.

③직쇄상 플라스미드인 PCR 산물을 Self-ligation함으로써 환상화하여 대장균의 형질전환에 제공합니다.

1. 결실 및 삽입 돌연변이의 효율 비교
7.3kb의 플라스미드 FLJ32066을 대상으로 본 제품과 A사 non-PCR법 키트를 이용하여 90염기의 결실 및 6xHis에 대응하는 18염기의 도입을 실시하였다. 그 결과, 타사의 키트가 서투른 결실이나 삽입 등의 변이 도입에 대해서도, 본 제품에서는 높은 효율로 변이체를 취득할 수 있었습니다.

●90bp 결실

●18bp 삽입

2. 목적외 변이(2nd-site mutation)의 삽입 빈도의 평가 키트 부속의 컨트롤 플라스미드(4.3kb)를 주형으로서 변이 도입을 실시(PCR은 8 사이클에서 실시), 얻어진 변이체로부터 24클론 각각 2,000bp의 영역의 시퀀싱을 실시했습니다. 그 결과, 본 제품에서는, 실제로 해석한 합계 48,000 염기 중, 목적 이외의 변이는 불과 1 염기였습니다. 이것은 A사 non-PCR법 키트와 비교해도 동등 이상의 결과였습니다.

실시 예 3 : 다양한 크기의 플라스미드를 표적화 한 경우의 돌연변이 도입 효율의 평가

(1) S. Arai et al., FEBS Letters, 581(29): 5649-5657(2007)
(2)Y. Torisu et al., Cancer Science,99(6): 1139-1146(2008)
(3)N. Shinmen et al., FEBS Letters.583(12): 1916-1922(2009)