PCR에 있어서, 이전에 실시한 PCR의 증폭 산물이 혼입된 것에 의해, 샘플 유래 이외의 DNA를 주형으로서 증폭이 일어나는 것을 캐리 오버 오염이라고 합니다. 이러한 경우에는 Negative Control에서도 표적 유전자의 증폭을 볼 수 있으며, 위양성이 발생하거나 정량 PCR을 실시한 경우는 과잉 평가를 해 버리는 경우가 있습니다.

PCR을 실시할 때, 미리 dUTP를 포함한 dNTPs를 이용해 실시하고, 다음에 PCR을 실시하기 전에 본 제품으로 처리를 하는 것으로, 캐리오버 오염을 방지하는 것이 가능합니다.

●PCR의 캐리오버 대책・위양성의 방지에 유용 ●높은 열감수성 때문에, PCR 뿐만이 아니라, RT-PCR에도 사용 가능

Uracil-DNA Glycosylase (UNG)는 데옥시실리보스와 우라실 염기 사이의 N-글리코시드 결합을 가수분해하여 탈염기 부위를 형성한다. 탈염기 부위를 가진 DNA는 열에 의해 분해되기 때문에 PCR의 주형이 되지 않습니다. dUTP를 이용하여 증폭한 PCR 산물만 UNG에 의해 분해되기 때문에, 템플릿 DNA의 증폭에는 영향을 주지 않고 캐리오버 오염된 PCR 산물만 분해합니다.

또한 본 제품은 열감수성이 높기 때문에 역전사반응(42℃이상)이나 PCR의 초기변성에 의해 실활하여 그 후의 반응에는 영향을 미치지 않습니다.

1. PCR 산물 분해능 확인

dTTP 대신 dUTP를 포함하는 dNTPs [Code No. NTP-501]를 이용하여 PCR을 실시. PCR 산물 100ng에 본 제품을 첨가하여 UNG 반응을 실시한 후, 전기영동을 실시했습니다. 그 결과, 37℃, 10min. 에서 PCR 산물이 분해되어 있는 것을 확인할 수 있었습니다.

PCR 산물 100ng ↓ 물 또는 UNG(2U) 첨가 ↓ 37 ℃ / 10min. (반응) ↓ 60℃ / 10min.(실활) ↓ 전기영동

2. 캐리오버 오염 방지 효과의 검증

비말한 증폭 산물이 다음의 PCR에 혼입한 케이스(캐리오버 오염)을 상정하고, 증폭 산물의 희석액을 주형으로 해 UNG 처리 후, 동 타겟의 검출을 실시했습니다. 그 결과, UNG 처리가 있는 경우, 1회째의 PCR의 증폭 산물이 분해되었고, 2회째의 PCR에서는 증폭이 인정되지 않았다.

3. UNG 처리 후 PCR 증폭 산물의 안정성

UNG 첨가 후 PCR을 실시한 경우, UNG가 PCR 중에 완전히 비활성화되지 않으면 분석 전에 PCR 산물이 분해되어 버릴 가능성이 있습니다. 따라서 UNG가 PCR 사이클 중에 완전히 비활성화되는지 확인한 결과, 본 제품은 비활성화되어 PCR 증폭 산물의 분해는 인정되지 않았습니다.

		물 또는 UNG(2U) ↓ PCR 사이클 95 ℃, 10 초. 50 ℃, 10 초. 30cycles 72℃, 30sec. ↓ PCR 산물 100ng 첨가 ↓ 25 ° C / 24 시간. ↓ 전기영동
	M:100bp DNA Ladder ①:물 ②:TOYOBO UNG [Code No. UNG-101] ③:A사 열감수성 UNG ④:B사 열감수성 UNG ⑤:C사 열감수성 UNG ⑥:A사 UNG

4. UNG 처리에 의한 RT-PCR 반응에 미치는 영향

UNG 2U를 THUNDERBIRD® Probe One-step qRT-PCR Kit [ Code No. QRZ-101 ]의 RT-PCR 반응액에 첨가하고, UNG 처리를 실시한 후, 실시간 RT-PCR로 엔테로바이러스 RNA를 검출한다 네. 그 결과, 열감수성의 UNG를 사용하지 않는 경우, Ct값의 지연이 인정되었지만, 본 제품을 사용한 경우는, Ct값의 지연이 인정되지 않았습니다.