고도 호열균 Thermus thermophilus HB8 유래의 내열성 DNA polymerase이며, 재조합체로 생산한 리콤비넌트 타입입니다.
본 효소는 역전사 활성을 가지며, 그 활성은 Mn ²⁺ 존재하에서 강하게 촉진됩니다. 이 성질을 이용하여 역전사 반응과 PCR을 동일한 효소로 실시할 수 있습니다(1-step RT-PCR).
또한 Taq DNA polymerase보다 내열성이 높고 GC-rich 타겟의 증폭 효율도 뛰어나다는 특징이 있습니다.

● 고효율
Taq DNA polymerase에 비해 GC-rich 타겟이나 크루드 샘플 등의 증폭 효율이 우수합니다.

● 1액계로 RT-PCR 가능 본 효소는 Mn ²⁺ 존재하에서 RTase 활성을 나타내므로 RT-PCR에 사용할 수 있습니다.
또한 60℃에서 RT 반응이 가능하기 때문에 GC-rich 타겟과 고차 구조를 취하기 쉬운 타겟의 증폭에도 적합합니다.

1.rTth DNA Polymerase를 이용한 게놈 PCR

본 효소를 이용하여 인간 게놈 50ng을 주형으로 하여 타겟 길이 180bp~1.3kb의 PCR을 실시하였다.
그 결과, 각각의 주형에 대해 양호한 증폭이 관찰되었다.
이 효소는 다양한 표적에 대해 PCR을 수행할 수 있습니다.

2. rTth DNA Polymerase를 이용한 RT-PCR 예

본 효소를 사용하여, 효모 Total RNA 1㎍을 주형으로 한, 액틴(타겟 길이 180bp와 300bp)의 RT-PCR, 및 2차 구조를 취하기 쉽다고 생각된 18S rRNA(380bp)의 RT-PCR을 인간 Total RNA(100pg, 10pg)를 주형으로 했습니다.
또한 18S rRNA는 M-MLV Rtase + Taq DNA Polymerase의 RT-PCR과의 비교를 실시했습니다.

RT 반응 조건
0.2mM dNTPs, 1mM MnCl ₂ , Reverse Primer 2pmoles / μL, 10U RNase Inhibitor 및 5U rTth DNA Polymerase를 포함하는 RT Buffer (10mM Tris-HCl (pH8.3), 90mM KCl) 20μL 중, 갔다.

PCR 조건
10×Chelating Buffer(100mM Tris-HCl(pH8.3), 1M KCl, 7.5mM EGTA, 0.5% Tween20)를 1×농도가 되도록 RT 반응액에 첨가한 후, Forward Primer를 0.4pmoles/μL, MnCl2 _를 1.88mM이 되도록 첨가하고, Final 100μL의 시스템에서 사이클을 실시하였다.



그 결과, 양호한 RT-PCR 결과를 얻을 수 있었다. 또 2차 구조를 취하기 쉽다고 생각된, rRNA를 주형으로 한 RT-PCR에 있어서는, 60℃에서 RT 반응을 행한 rTth DNA Polymerase 쪽이, M-MLV Rtase 42℃에서 실시한 것보다 강하다 증폭을 확인할 수 있었습니다.
이번에는 rTth DNA Polymerase를 사용했지만 Tth DNA Polymerase에서도 문제는 없습니다.
또한 원스텝 반응으로 RT 반응과 PCR을 반응하는 경우에는 본 효소를 사용한 키트 「 RT-PCR Quick Master Mix 」를 추천합니다.

1) TW Myers and DH Gelfand, Biochem. , 30 : 7661-7666(1991)
2) K. Yamada et al., J. Biochem. (Tokyo), 130 : 335-340(2001)