KOD -Multi & Epi- ^® 는 유전적으로 변형된 KOD DNA 중합효소(UKOD)를 사용하여 개발된 고정확성 PCR용 효소입니다.
변경에 의해, 지금까지 곤란했던 우라실을 많이 포함하는 주형이나 이노신을 포함한 프라이머 등을 이용할 수 있게 되었습니다. 또한, 신장 가속기 등의 첨가에 의해, 신장성이 향상됨으로써 서열이나 증폭 사이즈 등에 의한 증폭 바이어스를 받기 어려워졌습니다.
따라서 KOD-Multi & Epi- ^® 는 멀티플렉스 PCR이나 바이설파이트 처리 후의 DNA 증폭(후성 유전 분석), 메타게놈 분석 등 다양한 용도에 사용할 수 있습니다.
또, 본 효소는 Taq 폴리머라제의 약 11배의 정확성을 나타내기 때문에, 얻어진 증폭 산물은 클로닝을 통한 종래의 시퀀스 해석이나 차세대 시퀀스 등에 폭넓게 사용할 수 있습니다.

●균일한 증폭(저 바이어스)
1kb 이하의 단쇄 타겟으로부터 10kb 전후의 장쇄 타겟까지의 폭넓은 범위에서 특이적이고 균일한 멀티플렉스 PCR을 실시할 수 있습니다. GC의 편향에 의한 증폭에의 영향을 최소한으로 억제하고 있어, 게놈이나 트랜스크립트의 다양한 영역을 균일하게 증폭하는 것이 가능합니다.
이 특성을 살려 차세대 시퀀서 해석에 사용하는 증폭 산물의 조제에도 사용할 수 있습니다.

●우라실을 많이 포함한 DNA로부터의 증폭 바이설파이트 처리 후의 우라실을 많이 포함하는 DNA로부터 높은 효율로 증폭을 실시할 수 있습니다. 최대 약 1.5kb의 증폭을 확인하고 있습니다.

● 이노신이나 우라실을 포함한 프라이머에 ^대응 수 있습니다.

● 고정확도
Taq 폴리머라제의 약 11배의 정확성(KOD FX Neo와 동등)을 나타내며, 증폭 산물을 다양한 용도로 사용할 수 있습니다.

● 크루드 샘플에 대응 크루드 샘플의 영향을 받기 어렵고, 동식물의 라이세이트로부터의 제노타이핑이나 토양, 식품 샘플 등으로부터의 증폭 등에도 사용할 수 있습니다.

●고효율 신장 가속기를 첨가하는 것으로 PCR 효율이 향상하고, 싱글 플렉스 PCR에서는 신장 시간을 최단으로 15sec./kb까지 단축하는 것이 가능합니다.

※크루드 샘플이나 바이설파이트 처리를 실시한 DNA 샘플을 이용하는 경우나 장쇄의 멀티플렉스 PCR을 실시하는 경우는, 효율을 우선하기 위해 30~60sec./kb를 추천하는 경우가 있습니다.
자세한 내용은 사용 설명서를 참조하십시오.

1. 멀티플렉스 PCR 성능 비교

정제된 인간 게놈 DNA 및 혈액 샘플을 사용하여, 1kb 이하, 및 1~10kb의 복수의 타겟을 다양한 증폭 시약으로 멀티플렉스 PCR을 실시하여 성능을 비교하였다(50μL 반응계).
그 결과, KOD-Multi & Epi- ^® 를 사용한 경우에만 모든 조건에서 바이어스가 적은 양호한 결과를 얻을 수 있었습니다.
KOD-Multi & Epi- ^® 는 혈액 성분의 저해를 받기 어렵고, 정제 게놈 DNA로부터의 증폭과 마찬가지로 바이어스가 적은 증폭 결과를 나타냈다.

2. NGS를 이용한 장쇄 (10kb) 타겟의 다중 증폭에서의 바이어스 검증

10 종류의 10 kb의 타겟(그 중 5 종류의 타겟을 GC 함량 70%의 영역이 300 bp 이상 있는 영역을 포함한다)을 6 종류의 PCR 시약으로 증폭을 행하고, 증폭의 확인이 가능한 시약의 PCR 산물을 정제 그런 다음 Covaris ^® 로 단편화하고 Truseq ^® nano LT kit를 사용하여 라이브러리를 준비하고 Miseq ^® (illmina ^® )를 사용하여 시퀀스 분석을 수행했습니다. 가장 리드수가 많은 타겟을 기준(1.0)으로서 각각의 리드수의 비를 플롯했습니다.



전기영동의 결과에서는 레인 3,5의 B사의 시약에서도 양호한 증폭을 확인할 수 있었지만, NGS 해석의 결과, 증폭에 편향이 발생하고 있는 것을 알 수 있었다. 한편, KOD -Multi & Epi- ^® 는 10종류의 타겟에 있어서는 리드수의 비가 0.6~1.0 안에 있기 때문에 균질하게 증폭한 것을 알 수 있습니다.

3. 바이설파이트 처리 DNA의 증폭 효율 비교

메틸화되지 않은 시토신(C)은 바이설파이트 처리에 의해 우라실(U)로 변환되기 때문에 PCR 후에 시퀀스 분석에 의해 메틸화된 C를 구별할 수 있습니다. 이 처리에 의해, 타겟의 서열은 AT 리치가 되어, 또 단편화되기 때문에, 일반적으로 바이설파이트 처리된 DNA의 증폭은 어렵다고 되어 있습니다.



이 연구에서는 바이설파이트 처리를 실시한 Jurkat 세포 유래의 메틸화 DNA를 주형으로 사용하고, 900~1500bp의 증폭을 다양한 DNA 폴리머라제로 비교하였다. 그 결과, KOD -Multi & Epi- ^® 는 약 1.5kb까지의 타겟에 대해 좋은 결과를 보였습니다. 또한, 1583bp의 증폭 산물에 관해서, 클로닝 키트(TArget Clone ^TM -Plus-)를 이용하여 클로닝한 후, 시퀀스 해석을 실시하여, 바이설파이트 변환된 타겟이 증폭되고 있는 것을 확인했습니다(데이터 나타내지 않음) ).



또, TGFβ(917bp)에 대해서, 템플릿량의 검토를 실시했습니다. 그 결과 5ng까지 검출할 수 있었다. 바이설파이트 처리를 함으로써 DNA가 단편화되는 것으로 알려져 있지만, 이러한 샘플을 사용한 경우에도 KOD-Multi & Epi- ^® 를 사용하여 약 1kb의 타겟을 고감도 에서 검출할 수 있었다.

실시예 4: 이노신을 포함하는 프라이머에 대한 대응
실시 예 5 : 세로토닌 신경에서 DNA의 메틸화 분석
실시 예 6 : 이노신을 함유하는 프라이머를 이용한 1 단계 RT-PCR에 의한 노로 바이러스 유전자의 증폭