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KOD FX Neo
| Code No. | 포장 | 저장 온도 | 설명서 사양 | SDS | 법규제 ※ |
|---|---|---|---|---|---|
| Code No.KFX-201 | 포장 200U×1개(200회용) | 저장 온도 -20℃ | 설명서 사양
|
SDS
|
법규제 ※ 없음 |
| Code No.KFX-201X5 | 포장 (200U×1개)×5 | 저장 온도 -20℃ | 설명서 사양
|
SDS
|
법규제 ※ 없음 |
| Code No.KFX-201X10 | 포장 (200U×1개)×10 | 저장 온도 -20℃ | 설명서 사양
|
SDS
|
법규제 ※ 없음 |
용도
● PCR
설명
KOD FX Neo는 높은 성공률 PCR 효소 KOD FX에 새롭게 개발한 「신장 인핸서」를 응용한 PCR 효소입니다.
높은 증폭 효율을 유지하면서, 난 배열·미량의 주형 DNA·긴 타겟·크루드 샘플로부터의 증폭 효율이 한층 더 향상하고 있습니다.
특징
●신장성 업・게놈 DNA를 주형으로서 최대 40kb의 증폭이 가능 ・30 sec./kb의 고속 사이클을 실현
・고GC 타겟 등의 난서열의 증폭에 최적 또한, 항체를 이용한 핫 스타트법에도 대응하고 있어 특이성 좋게 증폭할 수 있습니다.
● 크루드 샘플로부터의 증폭 성능 향상・식물 라이세이트나 마우스 테일 등으로부터의 증폭 효율을 향상 ・토양 성분이나 식품 성분 등의 PCR 저해 효과를 저감 PCR 가능
원리
KOD DNA polymerase는 뛰어난 신장성을 가지며, 크루드 성분의 저해에 강한 등의 특징을 가지고 있습니다.
KOD FX는 이 특성을 이용하여 개발된 고성능률 PCR 효소이며, 난배열이나 크루드 샘플로부터의 증폭 등에 호평을 받고 있습니다. 그러나 KOD FX를 비롯해 기존의 PCR 효소는 20~30사이클 이후 증폭이 지속되지 않는 <플라토 현상>이 발생하여 PCR 기능이 완전히 발휘되지 않았습니다. 
「KOD FX Neo」는, KOD FX의 기술에, 당사에서 새롭게 개발한 「신장 인핸서」등의 기술을 응용하는 것으로, <플라토 현상>을 억제해, 긴 타겟이나 난배열 타겟, 크루드 샘플 등으로부터 의 증폭 효율을 더욱 향상시키는 데 성공했습니다.
실시예
1. 증폭 길이 비교
KOD FX Neo 및 종래품을 이용하여 인간 게놈 DNA를 주형으로 장쇄 타겟의 증폭을 실시했습니다. 그 결과, KOD FX Neo를 사용한 경우에만 지금까지 증폭이 어려웠던 40kb의 증폭을 확인할 수 있었습니다. 또, KOD FX Neo에서는 종래품에 비해, 신장 시간을 반(30sec./kb)으로 실시하는 것이 가능합니다*. 따라서 반응 시간을 대폭 단축할 수 있었습니다.
* 크루드 샘플에서는 1min./kb에서 실시하는 것이 좋습니다. 
2. 검출 감도의 비교
인간 게놈 DNA를 주형으로 하여 검출 감도의 비교를 실시했습니다.
그 결과 KOD FX Neo는 기존 제품에 비해 약 1자리수 감도의 향상을 인정했습니다. 
3. 증폭 비교
알칼리 용해법을 이용하여 조제한 마우스테일 라이세이트를 샘플로서 3종류의 마우스 유전자의 증폭을 실시하였다. 그 결과, KOD FX Neo에서만 모든 타겟에 대해 양호한 증폭이 확인되었다. 이와 같이 KOD FX Neo에서는 샘플을 직접 PCR에 반입할 수 있어 번잡한 정제를 생략할 수 있습니다. 
96 웰 PCR 플레이트를 이용한 마우스 테일 처리법 (알칼리 용해법)
마우스 테일(3mm 정도)을 96홀 플레이트에 넣는다
↓← 50 mM NaOH 180 μL를 넣고 뚜껑을 덮고 Vortex에서 잘 교반한다.
↓스핀다운(가볍게 흔들어 액을 아래로 떨어뜨리는 정도라도 문제 없습니다)
↓95℃, 10 min.인큐베이트(서멀 사이클러 사용)
↓←1 M Tris-HCl (pH 8.0) 20 μL를 넣고 뚜껑을 덮고 Vortex에서 잘 교반한다.
↓스핀다운(가볍게 흔들어 액을 아래로 떨어뜨리는 정도라도 문제 없습니다)
상청 (템플릿) ⇒ 0.5~2μL를 PCR 반응액 50μL에 첨가
※마우스 테일 절편은, 액에 담그도록 컷 해 주세요.
※열 알칼리에 주의해 주십시오.
※처리 후, 마우스 테일은 완전히 용해되지 않습니다. 마우스 테일의 표면이 녹는 정도입니다.
※ 본 방법은 1.5mL 마이크로 튜브 등을 사용해도 가능합니다.
※그 외의 실시예
실시예 4: 푸민산 첨가 실험
실시예 5: 원스텝 방법으로 제조된 식물의 라이세이트로부터의 증폭
실시예 6: 잼(식품) 첨가 실험
실시 예 7 : 퇴비 (퇴비)를 이용한 메타 게놈 분석
실시예 8: 마우스 클로를 이용한 직접 PCR
실시예 9: ES 세포에서의 유전자 재조합 결정
기타 실시예
참고 문헌
제품 내용
KOD FX Neo(1U/μL) 200μL×1개 2×Buffer for KOD FX Neo * [KFX-2B] 1.7mL×3개 2mM dNTPs[NTP-201] 1mL×2개 * 종농도 2.0mM의 Mg 2+ 를 함유합니다.
※50μL로 반응을 실시한 경우, 200회용으로서 사용하실 수 있습니다.활동 정의:
75℃에 있어서, 30분간에 10nmol의 전체 뉴클레오티드를 산 불용성 분획에 도입하는 효소량을 1U로 합니다.
기원:
E.coli 재조합체
- 주의사항
PCR에는 제품에 첨부되어 있는 dNTPs 또는 별매의 dNTPs Mixture (2mM) [NTP-201]을 사용해 주십시오. 다른 dNTPs에서는 충분한 성능을 얻지 못할 수 있습니다.
- 기본 반응 조건
멸균 증류수 XμL
2 x PCR buffer for KOD FX Neo 25μL
2mM dNTPs 10μl
10pmol/μL Primer F 1.5μL
10pmol/μL Primer R 1.5μlL
KOD FX Neo(1.0U/μl) 1μL
Genomic DNA 10~200ng
Plasmid DNA 1~50ng
cDNA ～200ng(RNA 상당)
크루드 샘플 ~2 μL <원스텝법의 식물 라이세이트는 1 μL>
Total 50μL
<2 스텝 사이클> *
94℃, 2min.
↓
98 ℃, 10 초.
68℃, 30sec./kb 25~45 cycles
<3 스텝 사이클> *
94℃, 2min.
↓
98 ℃, 10 초.
Tm ℃, 30 초.
68℃, 30sec./kb 25~45 cycles
<스텝다운 사이클> *
94℃, 2min.
↓
98 ℃, 10 초.
74℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98 ℃, 10 초.
72℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98 ℃, 10 초.
70℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98 ℃, 10 초.
68℃,30sec./kb 15~30 cycles
↓
68℃,7min.
*2 스텝 사이클을 기본으로 합니다. 프라이머의 Tm 값이 68℃ 미만이거나 2단계 사이클에서 증폭이 보이지 않으면 3단계 사이클을 사용해 보십시오. 또한 10kb 이상의 타겟을 증폭하는 Long PCR이나 엑스트라 밴드 혹은 스미어가 보이는 경우에는 스텝 다운 사이클을 시도해 보십시오.
※ 프라이머의 Tm값의 계산은 최근 접염기 대법(Nearest Neighbor method)을 이용하고 있습니다. 프라이머의 Tm값 계산표(EXCEL)는, 이쪽 으로부터 다운로드 받을 수 있습니다.
<알칼리 용해법>
1) 마우스 꼬리 (약 3mm)를 마이크로 튜브에 넣습니다.
2) 50mM NaOH를 180μL 첨가한다.
3) Vortex에서 잘 교반.
4) 95 ℃, 10 분.
5) Tris-HC (l pH 8.0) 20 μl를 첨가.
6) Vortex에서 잘 교반.
7) 원심(12,000rpm, 10min.)
8) 상청액 0.5~2 μL를 PCR 반응액에 첨가하였다.
(마우스 꼬리는 완전히 용해되지 않습니다)
<원스텝법>
1) 잎(3mm각) 또는 정미(1알)를 마이크로튜브에 넣는다.
2) Buffer A*를 100μL 첨가.
3) Vortex에서 잘 교반.
4) 95 ℃, 10 분.
5) Vortex에서 잘 교반.
6) 원심(12,000rpm, 10min.)
7) 상청액 1μL를 PCR 반응액에 첨가한다.
(식물 조직은 완전히 용해되지 않습니다)
*Buffer A:
100mM Tris-HC(l pH9.5)
1M KCl
10mM EDTA
- 원포인트 조언
●PCR 산물의 클로닝 본 효소의 PCR 산물은 평활화되어 있기 때문에, 평활 말단 클로닝법에 의해 클로닝할 수 있습니다.
그 때, 벡터측을 탈인산화 처리하고 있는 경우, 인산화를 행한 PCR 산물을 이용하거나, 인산화 프라이머를 이용하여 증폭한 PCR 산물을 이용할 필요가 있습니다.
또한, 본 효소의 PCR 산물은 평활화되어 있기 때문에, 그대로는 TA 클로닝할 수 없습니다. 전용의 고효율 TA 클로닝 키트 「TArget Clone TM -Plus-」를 이용하면 간편・고효율로 TA 클로닝이 가능합니다.
●프라이머에 대해서
10kb 이상의 타겟을 증폭하는 경우에는 카트리지 정제 이상의 등급으로 27mer 이상의 프라이머를 사용하는 것이 좋습니다. 또, 3'측에 미스매치가 있는 프라이머는, 본 효소에 의해 교정을 받는 경우가 있습니다.※ 프라이머의 Tm값의 계산은 최근 접염기 대법(Nearest Neighbor method)을 이용하고 있습니다. 프라이머의 Tm값 계산표(EXCEL)는, 이쪽 으로부터 다운로드할 수 있습니다.
●DNA 말단 평활화에 이용하는 경우는 이쪽을 봐 주세요.
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제품 내용
KOD FX Neo(1U/μL) 200μL×1개 2×Buffer for KOD FX Neo * [KFX-2B] 1.7mL×3개 2mM dNTPs[NTP-201] 1mL×2개 * 종농도 2.0mM의 Mg 2+ 를 함유합니다.
※50μL로 반응을 실시한 경우, 200회용으로서 사용하실 수 있습니다.활동 정의:
75℃에 있어서, 30분간에 10nmol의 전체 뉴클레오티드를 산 불용성 분획에 도입하는 효소량을 1U로 합니다.
기원:
E.coli 재조합체
- 주의사항
PCR에는 제품에 첨부되어 있는 dNTPs 또는 별매의 dNTPs Mixture (2mM) [NTP-201]을 사용해 주십시오. 다른 dNTPs에서는 충분한 성능을 얻지 못할 수 있습니다.
- 기본 반응 조건
멸균 증류수 XμL
2 x PCR buffer for KOD FX Neo 25μL
2mM dNTPs 10μl
10pmol/μL Primer F 1.5μL
10pmol/μL Primer R 1.5μlL
KOD FX Neo(1.0U/μl) 1μL
Genomic DNA 10~200ng
Plasmid DNA 1~50ng
cDNA ～200ng(RNA 상당)
크루드 샘플 ~2 μL <원스텝법의 식물 라이세이트는 1 μL>
Total 50μL
<2 스텝 사이클> *
94℃, 2min.
↓
98 ℃, 10 초.
68℃, 30sec./kb 25~45 cycles
<3 스텝 사이클> *
94℃, 2min.
↓
98 ℃, 10 초.
Tm ℃, 30 초.
68℃, 30sec./kb 25~45 cycles
<스텝다운 사이클> *
94℃, 2min.
↓
98 ℃, 10 초.
74℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98 ℃, 10 초.
72℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98 ℃, 10 초.
70℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98 ℃, 10 초.
68℃,30sec./kb 15~30 cycles
↓
68℃,7min.
*2 스텝 사이클을 기본으로 합니다. 프라이머의 Tm 값이 68℃ 미만이거나 2단계 사이클에서 증폭이 보이지 않으면 3단계 사이클을 사용해 보십시오. 또한 10kb 이상의 타겟을 증폭하는 Long PCR이나 엑스트라 밴드 혹은 스미어가 보이는 경우에는 스텝 다운 사이클을 시도해 보십시오.
※ 프라이머의 Tm값의 계산은 최근 접염기 대법(Nearest Neighbor method)을 이용하고 있습니다. 프라이머의 Tm값 계산표(EXCEL)는, 이쪽 으로부터 다운로드 받을 수 있습니다.
<알칼리 용해법>
1) 마우스 꼬리 (약 3mm)를 마이크로 튜브에 넣습니다.
2) 50mM NaOH를 180μL 첨가한다.
3) Vortex에서 잘 교반.
4) 95 ℃, 10 분.
5) Tris-HC (l pH 8.0) 20 μl를 첨가.
6) Vortex에서 잘 교반.
7) 원심(12,000rpm, 10min.)
8) 상청액 0.5~2 μL를 PCR 반응액에 첨가하였다.
(마우스 꼬리는 완전히 용해되지 않습니다)
<원스텝법>
1) 잎(3mm각) 또는 정미(1알)를 마이크로튜브에 넣는다.
2) Buffer A*를 100μL 첨가.
3) Vortex에서 잘 교반.
4) 95 ℃, 10 분.
5) Vortex에서 잘 교반.
6) 원심(12,000rpm, 10min.)
7) 상청액 1μL를 PCR 반응액에 첨가한다.
(식물 조직은 완전히 용해되지 않습니다)
*Buffer A:
100mM Tris-HC(l pH9.5)
1M KCl
10mM EDTA
- 원포인트 조언
●PCR 산물의 클로닝 본 효소의 PCR 산물은 평활화되어 있기 때문에, 평활 말단 클로닝법에 의해 클로닝할 수 있습니다.
그 때, 벡터측을 탈인산화 처리하고 있는 경우, 인산화를 행한 PCR 산물을 이용하거나, 인산화 프라이머를 이용하여 증폭한 PCR 산물을 이용할 필요가 있습니다.
또한, 본 효소의 PCR 산물은 평활화되어 있기 때문에, 그대로는 TA 클로닝할 수 없습니다. 전용의 고효율 TA 클로닝 키트 「TArget Clone TM -Plus-」를 이용하면 간편・고효율로 TA 클로닝이 가능합니다.
●프라이머에 대해서
10kb 이상의 타겟을 증폭하는 경우에는 카트리지 정제 이상의 등급으로 27mer 이상의 프라이머를 사용하는 것이 좋습니다. 또, 3'측에 미스매치가 있는 프라이머는, 본 효소에 의해 교정을 받는 경우가 있습니다.※ 프라이머의 Tm값의 계산은 최근 접염기 대법(Nearest Neighbor method)을 이용하고 있습니다. 프라이머의 Tm값 계산표(EXCEL)는, 이쪽 으로부터 다운로드할 수 있습니다.
●DNA 말단 평활화에 이용하는 경우는 이쪽을 봐 주세요.
※ 법규제에 대해서
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