KOD-Plus-Neo는 고정확성 PCR 효소 KOD-Plus-시리즈의 기술에 새롭게 개발한 「신장 인핸서」를 응용함으로써 높은 정확성(Taq DNA polymerase의 약 80배)을 유지하면서 , 미량의 주형 DNA로부터의 증폭이나 긴 타겟의 증폭 효율을 현격히 향상시킨 효소입니다.

● 미량의 주형 DNA로부터 정확하고 고효율의 증폭이 가능
신장 인핸서 기술을 응용함으로써 미량의 주형 DNA에서도 고정확하고 고효율로 목적 유전자를 증폭할 수 있게 되었습니다. 본 효소는 높은 정확성(Taq의 약 80배)을 나타내며, 낮은 카피수의 주형으로부터도 정확하게 목적 유전자를 증폭할 수 있습니다.

* PCR 에러율은 각 효소에서 인간 게놈 DNA를 주형으로 β-globin 유전자 (2.4kb)의 증폭을 실시하고, PCR 산물을 TA 클로닝 후 96 클론을 시퀀싱 해석하여 측정했습니다.

● 핫 스타트로 PCR 성능 향상
2종류의 항KOD 항체를 효소에 혼합함으로써, 비특이 반응의 원인이 되는 상온하에서의 Polymerase 활성과 3'→5'Exonuclease 활성을 억제하고 있습니다. 항체는 PCR의 첫번째 변성 단계에서 비활성화되고 증폭 반응에는 영향을 미치지 않는다.

● 신장 시간을 단축 <30sec./kb>(긴 타겟으로 보다 편리하게 되었습니다)
신장 시간을 기존 제품의 60sec./kb에서 30sec./kb로 단축. 긴 타겟으로 더 편리하게되었습니다.



●장쇄 타깃의 증폭 종래품보다 신장성이 향상해, 다양한 길이의 타깃을 증폭할 수 있습니다. 게놈 DNA로 24kb까지의 증폭을 확인하고 있습니다.

● 다양한 프라이머로 동일 온도 사이클 조건을 실현
20mer 이상의 프라이머(Tm값>63℃)에서는 우선 2스텝 사이클을 시험해 주십시오. 사이클 조건 검토는 필요하지 않습니다. (기본 반응 조건 참조)

*Tm값은 최근 접염기 대법(Nearest Neighbor Method)을 이용하여 계산한 값을 이용하고 있습니다.

KOD DNA polymerase는 강한 3'→5'엑소뉴클레아제 활성(교정 활성)을 가지고 정확하게 타겟 서열을 증폭할 수 있기 때문에 클로닝용 PCR 효소로 호평을 받고 있습니다.
그러나 고정확성 PCR 효소는 20~30 사이클 이후 증폭이 지속되지 않는 <플라토 현상>이 나오기 쉽다고 합니다.

KOD-Plus-Neo는 고정확성 PCR 효소 KOD-Plus-시리즈의 기술에 당사에서 새롭게 개발한 "신장 인핸서"를 응용하여 Taq의 약 80배라는 KOD -Plus-시리즈의 높은 정확도 성을 유지하면서, <플라토 현상>을 억제함으로써, 미량의 주형 DNA로부터의 증폭이나 긴 타겟의 증폭 효율을 현격히 향상시키는 것에 성공했습니다.

1. Total RNA에서 전장 ORF 증폭

HeLa cell 유래 Total RNA 1㎍으로부터 합성한 cDNA 약 50ng을 사용하여, 다양한 단백질 키나아제의 ORF(open reading frame)의 전장을 증폭했습니다.
사이클은 각 효소의 최적 조건에서 30 사이클 실시했습니다.
그 결과, KOD-Plus-Neo로 증폭한 경우에만 모든 유전자에서 명확한 증폭 산물을 얻을 수 있어 모든 ORF를 신속하게 클로닝할 수 있었다.

2. β-globin 유전자 상의 각 영역에서의 증폭 효율·신장성의 비교

Human genomic DNA 50ng을 이용하여 다양한 크기의 β-globin 유전자의 증폭을 실시했습니다. 반응은 각 PCR 효소의 권장 조건에 따라 동일한 사이클 수로 실시했다.
그 결과, KOD-Plus-Neo를 사용한 경우에만 17.5kb까지의 명확한 증폭을 확인할 수 있었다. 또한 17.5kb 이하의 증폭에서도 타사 PCR 효소를 크게 상회하는 수율이 인정되었습니다.

3. 장쇄 타겟의 증폭

인간 게놈 DNA(200ng)를 템플릿에 다양한 프라이머 농도로 β-globin 유전자(17.5kb), tPA(Human tissue-type plasminogen activator) 유전자(24.0kb)의 증폭을 실시했습니다. 그 결과 장쇄 타겟의 증폭은 프라이머 농도를 낮추면 증폭량이 증가하는 것으로 나타났다.

이와 같이 10kb 이상의 장쇄 타겟을 증폭하는 경우는 프라이머 농도를 0.15μM(종농도)로 이용해 주십시오. 증폭량이 향상될 수 있습니다.

1) M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol. , 63 : 4504-4510 (1997)
2) H. Hashimoto et al., J. Biochem. (Tokyo), 125 : 983-986 (1999)
3) H. Mizuguchi et al., J. Biochem . (Tokyo), 126 : 762-768 (1999)
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5) H. Hashimoto et al., J. Mol. Biol. , 306 : 469-77 (2001)
6) T. Imanaka et al., J. Chin. Inst.Chem. Engrs. , 32 : 277-288 (2001)