THUNDERBIRD ^® Next SYBR™ qPCR Mix는 기존의 THUNDERBIRD ^® qPCR Mix의 조성을 크게 개선한 제품입니다. PCR 효율을 높이고 비특이 반응(프라이머 다이머 등의 발생)을 억제함으로써 폭넓은 정량 가능 영역(다이나믹 레인지)을 얻을 수 있습니다.

2×농도의 프리믹스 시약으로 되어 있으며, 프라이머 이외의 성분이 미리 혼합되어 있습니다. 또한 실시간 PCR 반응이나 신호에는 영향이 없는 청색 색소로 착색되어 있어 피펫팅 시 시약이 보기 쉽기 때문에 분주 미스를 방지합니다.

THUNDERBIRD ^® Next SYBR™ qPCR Mix는 SYBR™ Green I 검출 시스템을 통한 실시간 PCR을 위한 범용 사양의 passive reference dye를 포함하는 프리믹스 시약입니다. 반응액 조제를 간편화할 수 있음과 동시에, 시료간의 형광 강도의 편차가 최소한으로 억제되어, 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

● 증폭 효율의 향상 조성의 개량에 의해 PCR 효율이 향상하고 있습니다.

● low copy 영역의 검출 감도 향상 고효율, 한편 특이적인 증폭에 의해, 넓은 측정 레인지로 해석이 가능합니다.

● 높은 특이성 조성 최적화로 PCR의 특이성이 향상되었습니다. 비특이적 반응을 줄임으로써 저농도 타겟의 검출에 대한 신뢰성이 향상되었습니다.

●신장 시간 10초의 고속 사이클에도 대응

●조제 후의 반응액의 안정성 향상 프라이머·템플릿 혼합 후의 PCR 반응액의 안정성이 높기 때문에, 샘플수가 많아 조제에 시간이 걸리는 경우에서도 안정된 결과를 얻을 수 있습니다.

●Carryover에 의한 위양성 방지 본 제품의 조성 중에는 dUTP가 포함되어 있습니다.
별매의 Uracil-DNA Glycosylase(UNG), Heat-labile[ Code No. UNG-101 ]을 첨가하는 것으로, 캐리 오버 오염에 의한 위양성을 방지할 수 있습니다.

●보정 dye 함유로 ROX 첨가가 불필요 보통 보정 이 필요한 장치에서도 ROX 첨가가 불필요합니다. 또한 포함된 보정 dye는 SYBR™ Green I의 검출에 영향을 미치지 않기 때문에 다양한 기기에 대응하고 있습니다.

●착색제이기 때문에, 분주 실수를 막음

1.100~500bp 영역의 증폭

인공 유전자를 주형으로, 포워드 프라이머를 공통으로 증폭 산물이 100bp, 200bp, 300bp, 400bp, 500bp가 되도록 리버스 프라이머를 설계했습니다. 이러한 프라이머를 이용하여 THUNDERBIRD ^® Next SYBR™ qPCR Mix 및 각사 실시간 PCR 시약으로 10⁷~10¹ 카피의 증폭을 실시하여 증폭마다 PCR 효율을 비교했습니다. 그 결과, 타사품에서는 증폭 효율이 저하 혹은 검출 불가가 되는 400bp 이상의 타겟에서도 본 제품에서는 증폭 효율의 저하가 인정되지 않았습니다.


증폭 효율 (PCR 효율)이란?
희석 계열을 이용하여 검량선을 작성하고, 이 검량선의 기울기(Slope)로부터 증폭 효율을 산출할 수 있습니다.
예를 들어, 검량선의 기울기(Slope) 값이 -3.322이면 다음과 같이 계산됩니다.
E = 10 ^(-1/-3.322) -1 = 10 ^0.301 -1 = 1.999-1 = 0.999(99.9%)
이 값이 1(100%)에 가까울수록 PCR 효율이 높고, DNA가 1사이클마다 2배로 증가하고 있는 이상적인 상태가 됩니다.

2.1 카피로부터의 증폭

1복사의 타겟이 증폭 가능할 경우, 1복사의 검출수가 포아송 분포로부터 예상되는 검출수와 동등하게 된다고 생각됩니다. 포아송 분포로부터의 이론치에서는, 0 카피가 될 확률이 37%, 1 카피 이상이 될 확률이 63%가 됩니다.
그래서 THUNDERBIRD ^® Next SYBR™ qPCR Mix를 이용하여 희석한 1 카피의 살모넬라 게놈을 주형으로 하고 N=96으로 검출을 실시했습니다. 그 결과, 미검출이 38.5%, 검출이 61.5%이며, 포아송 분포로부터 상정되는 검출률과 동등하고, 1 카피 상당이 검출되는 것이 시사되었습니다.

3.G3PDH의 65bp 영역 증폭

역전사 반응용 시약 ReverTra Ace ^® qPCR RT Kit [ Code No. FSQ-101 ]에 의해 합성한 HeLa 세포 total RNA 유래의 cDNA를 이용하여, cDNA의 5배 희석(5단계)에 대해 증폭 65bp의 G3PDH의 증폭 했습니다.

그 결과, ^{THUNDERBIRD®} Next SYBR™ qPCR Mix 이외에서는 저카피 영역에서 비특이 증폭이 발생했지만, 본 제품에서는 비특이 증폭이 인정되지 않고, 저 카피까지 정량이 가능했습니다.

4. 조제한 PCR 반응액의 안정성

PCR 반응액에 프라이머, 템플릿(HeLa 세포 total RNA 유래의 cDNA)을 혼합한 직후 또는 차광 실온에서 48시간 인큐베이션한 후 타겟의 증폭을 행하였다. 그 결과, 타사품에서는 48시간 후에 Ct값의 저하가 인정되었지만, ^{THUNDERBIRD®} Next SYBR™ qPCR Mix에서는 48시간 후에도 안정된 성능을 나타냈다. ΔCt가 0.5 이상인 차이를 노란색 하이라이트로 표시합니다.

5.UNG 첨가에 의한 캐리오버 오염 방지 효과

엔테로바이러스 RNA를 주형으로 하고, dUTP를 포함한 RT-PCR 시약으로 196bp의 타겟의 증폭을 실시했습니다. 그 PCR 산물(10⁴ 카피)을 주형으로 하고, THUNDERBIRD ^® Next SYBR™ qPCR Mix와 Uracil-DNA Glycosylase(UNG), Heat-labile[ Code No. UNG-101 ]을 첨가하고, 리얼타임 PCR로 1회째의 PCR 와 같은 타겟의 증폭을 실시했습니다.

그 결과, UNG 처리를 실시함으로써 1회째의 PCR 산물이 분해되고, 2회째의 PCR에서는 증폭이 인정되지 않았다.

6. 통상 사이클·고속 사이클의 비교

역전사 반응용 시약 ReverTra Ace ^® qPCR RT Kit [ Code No. FSQ-101 ]에 의해 HeLa 세포로부터 합성한 cDNA를 이용하여, 5배 희석(5단계)에 대해서, 타겟 길이 316bp의 β-actin의 증폭을 「신장 시간 30초의 통상 사이클" 및 "신장 시간 10초의 고속 사이클"로 실시했습니다.
그 결과, 통상 사이클을 추천하는 타사품에서는 고속 사이클에서 효율적인 증폭을 할 수 없었지만, ^{THUNDERBIRD®} Next SYBR™ qPCR Mix에서는 고속 사이클에서도 효율적인 증폭이 가능했습니다.

<일반 사이클>					<고속 사이클>
95℃	60 초.				95℃	30 초.
95℃	15 초.		40cycles		95℃	3 초.		40cycles
60℃	30 초.				60℃	10 초.
융해 곡선 해석					융해 곡선 해석

<제품 사용 문헌>
Takai J. et al., iScience 24, August 20,102836 (2021)
https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102836