KOD SYBR™ qPCR Mix는 SYBR™ Green I 검출 시스템에 의한 실시간 PCR용 2x 농도의 마스터 믹스 시약입니다. 본 시약은 ROX(별첨)와 프라이머 이외의 성분이 미리 혼합되어 있습니다. 그 때문에, 반응액 조제를 간편화할 수 있는 동시에, 시료간의 형광 강도의 편차를 최소한으로 억제하여, 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.
본 제품은 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성(교정 활성)을 제거한 KOD exo(-) DNA polymerase와 최적화된 버퍼 조성을 조합함으로써 KOD의 우수한 합성능과 크루드 성분의 저해를 받기 어려운 성질을 SYBR™ Green I을 이용한 인터컬레이션 분석에서 최대한 발휘시킬 수 있게 되었습니다.

● 증폭이 어려운 타겟에 대응

KOD DNA polymerase를 사용하는 것으로, Taq DNA polymerase를 이용하는 이전에는 어려운 GC-rich 타겟, 다염기 서열이나 프로모터 근방의 2차 구조를 취하기 쉬운 타겟에 있어서도, 정량적 증폭이 허용됩니다. 

●길이가 긴 타겟(~2kb)에 대응

KOD FX나 KOD -Plus- 시리즈 등의 일반 PCR용으로 설계한 프라이머를 그대로 사용하실 수 있습니다. 길이가 긴 타겟에서도 증폭할 수 있기 때문에 프라이머의 선택 폭을 현격히 넓힐 수 있습니다.

2kb까지의 다양한 타겟 길이를 선택할 수 있으므로 폭넓은 융해 곡선 해석이 가능합니다. 프라이머 다이머의 발생 영역(단쇄 영역)을 제외하고 증폭 영역을 선택할 수 있기 때문에 엔드포인트 분석에서의 다형 해석, 멀티플렉스 PCR 해석 등에 유리합니다. 

● Crude 샘플 가능

식물 Lysate, 마우스 테일 알칼리 열 추출액, 혈액 등의 crude 샘플을 사용하여 직접 검출할 수 있습니다. SYBR ™ Green 분석을 적용하면 복잡한 다형성 분석과 SNP 분석을 간소화할 수 있습니다.

● 높은 특이성

프라이머 다이머 등의 비특이적 반응을 억제함으로써, Low copy 영역까지의 폭넓은 정량이 가능합니다. 또한, 당사 실시간 PCR용 cDNA 합성 키트 「ReverTra Ace ^® qPCR RT 시리즈」를 병용함으로써 안정적인 검출을 얻을 수 있습니다 . 

● 다양한 기기에 호환 가능

블록 타입의 기기(Fast Mode에도 대응) 외에 유리 모세관을 이용한 고속 사이클러에도 대응하고 있습니다. 또 50×ROX reference dye가 별도 첨부되어 있기 때문에, 패시브 레퍼런스를 필요로 하는 기기에 있어서도 각 기기에 적합한 ROX 농도로 사용할 수 있습니다.

【대응 가능 기기 예】

1. 증폭 곤란한 타겟 검출

●GC 풍부한 타겟
GC 함량이 70%를 초과하는 타겟에 대해, 각 실시간 PCR 시약에 의한 반응성의 비교를 실시했습니다. 주형에는, 당사의 고성능 역전사 반응용 시약 ReverTra Ace ^® qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101]에 의해 합성한 HeLa 세포 total RNA 유래의 cDNA를 사용하여, cDNA의 5배 희석(5단계)에 대해서 , 반응을 실시했다. 그 결과, 폐사 종래품에서는, 증폭 곤란했던 GC-rich인 타겟에 대해서도, 정량적인 증폭이 인정되었습니다. 또한, 반응 특이성이 높고, 프라이머 이량체가 발생하기 어렵기 때문에, 저 카피까지의 폭넓은 정량 가능 영역을 얻을 수 있었습니다.


                              그림 GC 풍부한 대상에 대한 실시간 PCR (ABI StepOnePlus ^TM 사용)

●GC 함량에 편향이 있는 타겟 인간 게놈을 템플릿으로, 배열 중의 적자로 나타낸 부분을 Primer 배열로서 사용해, 해석을 실시했습니다.
그 결과, 본 제품에서는 정량적인 증폭이 인정되어, 2차 구조를 취하기 쉬운 타겟에서도 유효한 것을 확인할 수 있었습니다.


          그림 GC 함량에 편향된 프로모터 영역에 대한 실시간 PCR (ABI StepOnePlus ^TM 사용)

2. 장쇄 타겟 검출

● 2kb 타겟 분석
KOD FX 시리즈나 KOD-Plus-시리즈로 증폭 가능한 프라이머를 이용하여 약 2kb의 타겟의 증폭을 실시했습니다. 그 결과, Taq DNA 폴리머라제를 이용한 종래품에서는 증폭 곤란한 약 2kb의 타겟에서도 본 제품에서는 정량적인 증폭이 인정되었습니다.

    그림 긴 사슬 타겟에 대한 실시간 PCR (ABI StepOnePlus ^TM 사용)

● 증폭 길이가 다른 타겟의 해석 인간 게놈 DNA를 주형으로 β-액틴 유전자상의 증폭 길이가 다른 타겟의 증폭 및 융해 곡선 해석을 실시했습니다. 그 결과, 60bp~약 1kb까지의 증폭 산물이 얻어져, 74~87℃의 폭넓은 온도 영역에서 이번 증폭한 증폭 산물의 식별이 가능했습니다. 그 때문에, 증폭 길이를 바꾸어 용융 온도에 차이가 생기도록 프라이머를 설계하는 것으로 원 튜브에서 복수의 타겟의 검출이 가능해집니다. 이 용융 곡선의 차이는 GC 함량에 따라 다르지만 증폭 산물의 Tm 값을 계산하여 예측할 수 있습니다.


  그림 증폭 길이가 다른 타겟을 이용한 분석 (ABI7500 사용)

3. 크루드 샘플(마우스 테일)의 검출

마우스 테일 알칼리 열 추출액을 이용하여 원 튜브에서 제노타이핑 해석을 실시했습니다. WT 특이적 증폭 산물과 knock-in 특이적 증폭 산물의 증폭 길이를 바꾸는 것으로 계산상 증폭 산물의 Tm 값에 차이가 생기도록 설계했습니다. WT 특이적 프라이머는 CreER knock-in에 대해서는 증폭 길이가 길기 때문에 신장 시간을 30초로 짧게 함으로써 증폭할 수 없게 하고 있습니다. 또한, 헤테로 검출에 있어서의 피크비의 밸런스를 취하기 위해서, WT 특이적 프라이머:knock-in 특이적 프라이머=1:3로서 검출의 결과, 모든 타입에서 증폭이 인정되어 제노타이핑을 실시할 수 있다 네.


    그림. 용융 곡선 분석을 이용한 원 튜브 마우스 제노 타이핑 (ABI 7500 사용)

기타 실시예

<크루드 샘플의 해석 예>
실시예 4: ASP(Allele specific primer)-PCR을 이용한 SNP(Single nucleotide polymorphism) 분석
실시예 5: 식물 잎으로부터의 검출
실시 예 8 : 크루드 샘플 (균액)을 이용한 실시간 PCR
실시 예 9 : 생물 농약 사상균의 특이 적 검출 및 정량
<증폭이 어려운 타겟의 성공 예>
실시 예 6 : 프라이머 이량 체가 발생하기 쉬운 표적 검출
실시예 7: 게놈 DNA 상대 정량  
실시예 10: ChIP 타겟의 효과적인 증폭

1) RM de Breuil et al., PCR Methods Appl ., 3 : 57-59 (1993)