GenNext ^® NGS Library Quantification Kit는 일루미나 차세대 시퀀서용 라이브러리 정량 키트입니다.
일루미나 차세대 시퀀서에서는 로드하는 라이브러리의 양이 데이터의 양과 품질에 큰 영향을 미칩니다. 라이브러리의 양이 적으면 클러스터 밀도가 낮아지고 결과 시퀀스 데이터의 양이 줄어듭니다. 반대로 라이브러리 양이 너무 많으면 클러스터 해상도가 나빠지고 데이터 품질이 떨어집니다. 따라서 라이브러리를 정확하게 정량화하는 것이 매우 중요합니다.

라이브러리를 정량하는 방법으로서 분광광도 측정이나 형광 측정이 있습니다만, 이러한 측정법에서는, 모든 DNA를 측정하기 위해, 시퀀스에 유효한 P5, P7 태그가 부가한 DNA의 농도를 정확하게 구하는 것 수 없습니다.
GenNext ^® NGS Library Quantification Kit는 일루미나가 채택한 P5, P7 서열에 어닐링하도록 설계된 프라이머를 이용한 qPCR 방법으로 분석하기 때문에 플로우 셀에 결합하는 유효한 라이브러리의 농도를 정확하게 에 정량할 수 있습니다. 또, KOD SYBR™ qPCR Mix를 채용하고 있기 때문에, 장쇄나 GC 리치 타겟에 있어서도, 안정된 라이브러리 정량이 가능합니다.

● 낮은 바이어스로 정확한 정량
KOD SYBR™ qPCR Mix를 채용하고 있어 라이브러리의 GC 함량이나 사이즈에 영향을 받기 어렵고, 어떠한 라이브러리에서도 정확한 정량값을 얻을 수 있습니다. 본 제품에서 정량한 값을 이용함으로써 안정된 클러스터 밀도를 실현할 수 있습니다.

● 폭넓은 레인지로 정량 가능
20pM에서 0.0002pM까지의 6가지 농도의 Standard DNA가 준비되어 있어 다양한 범위에서 정확하게 정량할 수 있습니다.

● 간편 본 제품은 라이브러리 정량에 필요한 모든 시약(qPCR 시약, Primer Mix, Standard DNA 및 라이브러리의 희석 버퍼)을 포함하여 쉽게 라이브러리의 정량을 할 수 있습니다.

1. 다양한 타겟 크기에서 PCR 효율

어댑터 서열을 가진 150~800bp의 타겟에 대해 각사 라이브러리 정량 키트를 이용하여 해석하여 PCR 효율을 비교했습니다. 그 결과, 타사 라이브러리 정량 키트에서는 타겟 사이즈가 길어짐에 따라 PCR 효율의 저하가 보였지만, 본 제품에서는 타겟 사이즈에 의한 PCR 효율의 저하는 인정되지 않았습니다.

2. 다양한 GC 함량의 타겟에서 PCR 효율 비교

어댑터 서열을 갖는 다양한 GC 함량의 타겟에 대해 각 회사 라이브러리 정량 키트에서 PCR 효율을 비교했습니다. 그 결과, 타사 라이브러리 정량 키트에서는 GC 함량이 높은 타겟에 관해서 아래 그림의 융해 곡선과 같이 목적 타겟이 증폭하지 않아 PCR 효율을 측정할 수 없었습니다. 한편, 본 제품에서는 모든 타겟을 특이적으로 증폭할 수 있어 PCR 효율의 변동이 가장 작은 결과가 되었습니다.
일반적으로 CpG를 포함하는 프로모터 영역이나 호열균 등의 박테리아에서는 GC 함량이 높은 것으로 알려져 있습니다. 이러한 라이브러리의 정량에는, GC의 영향을 받기 어려운 본 제품을 사용하는 것으로 정확하게 정량할 수 있습니다.

3. 2차 구조를 형성하기 쉬운 단쇄 타겟을 이용한 검토

어댑터 서열을 부가한 miRNA(human let-7a) 서열(144bp)과 Standard DNA를 템플릿으로 한 해석으로 얻은 증폭 곡선을 비교했습니다. miRNA 타겟은 20pM까지 희석한 후, 10배로 단계 희석하고, 키트 첨부의 Standard DNA와 동시에 해석을 실시했습니다.

그 결과, miRNA 타겟과 Standard DNA의 증폭 곡선은 각 희석 수준에서 거의 일치하고, PCR 효율도 97.8%(miRNA)와 97.1%(Standard DNA)와 거의 동등했다. 본 검토에 의해 miRNA와 같은 단쇄의 타겟에서도 본 제품을 사용함으로써 정확하게 정량할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<제품 사용 문헌>
Katsuya H., et al., Cell Reports, 29: 724–735 (2019)
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.09.016
Kim Hyo-Eun, et al., Food Research International 122: 517–527 (2019)
https://doi.org/10.1016/j.foodres.2019.05.032