SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR [Code No. SCQ-101]은 실시간 PCR에 의한 유전자 발발현 분석을 위한 ^세포 lysis 시약과 역전사 반응 시약(RT Reagents)으로 이루어진 키트입니다. 96 웰 플레이트에서 배양한 세포로부터, 역전사 반응의 주형으로서 이용 가능한 RNA 를 포함한 세포 Lysate 를 간편하게 조제할 수 있습니다. 또한, 본 키트에 포함된 역전사 시약은 이 세포 용해 추출물로부터의 역전사 반응에 최적화되어 있습니다. 이 키트는 간편하고 신속하게 Culture Cell에서 cDNA의 합성을 가능하게하고 High throughput screening에 적합합니다.
SuperPrep ^® Cell Lysis Kit for qPCR [Code No. SCQ-201]은 세포 용해 시약 (Lysis Reagents)의 별매품입니다. 당사의 RNA-direct ^® Realtime PCR Master Mix [ Code No. QRT-101, QRT-201 ] 등의 1-step 실시간 PCR 시약을 이용한 해석(간이 측정)에도 사용할 수 있습니다.

●RNA 추출 불필요

세포를 PBS(-)로 wash 후, Lysis Solution(gDNA Remover 첨가)을 세포에 넣어 잘 혼합하여 실온에서 5분간 인큐베이션함으로써, 세포 Lysate와 gDNA의 분해를 동시에 실시합니다. 반응 정지는 Stop Solution을 첨가하여 처리하며 추가적인 열처리가 필요하지 않습니다.
역전사 반응은 세포 Lysiate(희석 불필요)를 첨가하고 25분간 인큐베이션합니다.

●Lysate로부터 고품질의 cDNA를 합성

Lysate로부터 고품질의 cDNA를 합성을 하기 위한 최적화된 buffer로, RNase등으로 인한 RNA의 분해를 효과적으로 억제합니다(Lysate는 ice에서 최대 2시간까지 보관 가능합니다). 또한 gDNA Remover (DNase I) 처리 후에 cDNA 합성을 실시함으로써 gDNA의 오염이 적은 고품질의 cDNA를 합성할 수 있습니다.
cDNA 합성 시약은 당사의 고효율 역전사효소 「ReverTra Ace ^® 」으로 최적화된 마스터 믹스※가 되어 있어 간편・고효율로 cDNA 합성을 실시할 수 있습니다. 합성한 cDNA는 장기 보관 가능합니다.
※마스터 믹스에는 Random primer와 Oligo dT primer가 최적 비율로 혼합되어 있습니다.

●High throughput screening에 적합

High throughput screening에 특화되어 있으며, 프로토콜에 gDNA remover와 RNase inhibitor가 포함되어 있어 추가적인 실험단계와 시간을 단축시켰습니다.

● 다양한 실시간 PCR 시약과 함께 사용 가능

 THUNDERBIRD ^® Next SYBR™ qPCR Mix [ Code No. QPX-201 ]를 비롯하여 SYBR™ Green I, TaqMan ^® TOYOBO의 모든 qPCR 시약과 조합 가능하며 고효율의 결과를 얻을 수 있습니다. 또한 RNA-direct ^® RealtimePCR Master Mix [ Code No. QRT-101, QRT-201 ] 등의 1-step 실시간 PCR 시약도 조합이 가능합니다.

1. 정제 된 RNA와 세포 용해 추출물에서 Ct의 상관 관계 검증

SuperPrep ^® Cell Lysis & RT Kit for qPCR을 사용하여 HEK293 세포 2.5 x 10 ⁴ 세포에서 cDNA를 합성했습니다 (40 μL 반응). 또한 HEK293 세포에서 추출한 Total RNA 66.6ng에서 ReverTra Ace ^® qPCR RT Master Mix [ Code No. FSQ-201 ]를 이용하여 cDNA 합성 (40 μL)을 실시했습니다. 그 후, 각각의 cDNA를 주형에 THUNDERBIRD ^® SYBR™ qPCR Mix[ Code No. QPS-201 ]를 이용하여 15종류의 House Keeping Gene에 대해 qPCR을 실시하여, 얻어진 Ct값의 상관성을 검증했습니다.
그 결과, 이번 해석한 15종류의 유전자에 있어서, 정제 RNA와 세포 용해 추출물를 사용한 결과에 양호한 상관이 인정되었습니다.

2. 편차를 고려한 분석 정밀도의 평가

HeLa S3 세포를 96웰 플레이트에 2×10 ⁴ cells/well씩 처하고, 100nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)를 첨가하여 24시간 인큐베이션하였다. 그 후, PMA 처리한 12 웰, 미처리한 12 웰에 대해 PBS(-)로 세포를 wash하고, SuperPrep ^® Cell Lysis & RT Kit for qPCR로 처리하여 cDNA 합성을 실시했습니다. 이 cDNA으로 THUNDERBIRD ^® Probe qPCR Mix [ Code No. QPS-101 ]를 사용하여 IL-6, IL-1β, β-actin 유전자에 대해 TaqMan ^® probe 분석을 실시했습니다 (n=12) . 마찬가지로 A사를 사용하여 qPCR를 진행 했습니다(역전사 반응 시약과 실시간 PCR 시약도 A사 키트 구성품 사용). IL-6, IL-1β 유전자의 Ct값을 β-actin 유전자로 보정하고(ΔCt), PMA 처리의 유무의 차이(ΔΔCt)를 산출했습니다. 계속해서 Z'-factor를 산출해, 비교를 실시했습니다.



이 결과, 모두 Z'-factor 0.5 이상 나타났지만, SuperPrep ^® Cell Lysis & RT Kit for qPCR, THUNDERBIRD ^® Probe qPCR Mix [ Code No. QPS-101 ] 사용한 실험에서, A사의 시약에 비해 높은 Z'-factor를 나타내고, 변동이 적고 양호한 것을 알 수 있었다.

3. RNase 활성이 강한 세포에서의 결과의 검증

단핵구 유래의 세포주 U937은 비교적 RNase의 활성이 높고, 세포 용해액을 이용한 검정은 어렵다고 여겨져 왔다. 본 실험에서는, U937 세포 1×10 ⁴ , 1×10 ³ , 1×10 ² , 1×10cells로부터 조제한 세포 Lysate 8 μL를 사용하여 cDNA 합성(40 μL)을 행한 후, THUNDERBIRD ^® SYBR™ qPCR Mix [ Code No. QPS-201 ]를 이용하여 β-actin 유전자에 대해 qPCR을 실시했습니다.
마찬가지로, A사를 사용하여 같이 수행하였다(역전사 반응 시약과 실시간 PCR 시약도 A사 키트 구성품을 사용). 또한, 동일한 샘플로부터 정제한 Total RNA를 이용하여 수행하였다. (ReverTra Ace ^® qPCR RT Master Mix [ Code No.FSQ-201 ], THUNDERBIRD ^® SYBR ™ qPCR Mix [ Code No.QPS-201 ] 사용).
이 결과, SuperPrep의 결과에서만, 정제 RNA를 이용했을 경우와 마찬가지로 높은 직선성을 나타냈습니다.

실시예 4. 부유 세포의 96웰 플레이트 분석 및 유전자 발현 분석의 사례

실시예 5. 세포 라이세이트의 빙상 안정성 확인