SuperPrep® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR [Code No. SCQ-401]은 qPCR 유전자 발현 분석을 위한 ^세포 lysis 시약과 역전사 반응 시약(RT Reagents)으로 이루어진 키트입니다. 96 웰 플레이트에서 배양한 세포로부터, 역전사 반응의 주형으로서 이용 가능한 RNA 를 포함한 세포 Lysate 를 간편하게 조제할 수 있습니다. 또한, 본 키트에 포함된 역전사 시약은 이 세포 용해 추출물로부터의 역전사 반응에 최적화되어 있습니다.
이전 버전에서는 Lysis Solution 이후에 Stop Solution을 추가해야 했지만 SuperPrep ^® II에서는 Lysis Solution으로 처리 한 후 cDNA 합성 단계로 바로 진행 할 수 있습니다. 또한 다양한 포유류 세포로부터 고감도 검출이 가능하게 되었습니다. 이 키트를 사용하면 간편하고 신속하게 배양 세포에서 qPCR 용 cDNA를 합성 할 수 있습니다.
당사 THUNDERBIRD ^® Probe qPCR Mix [ Code No. QPS-101 ], KOD SYBR™ qPCR Mix [ Code No. QKD-201 ] 등과 조합하여 사용하여 Culture Cell에서 간단하게 고효율의 결과를 확인할 수 있습니다.
SuperPrep ^® ⅡCell Lysis Kit for qPCR [Code No. SCQ-501]은 세포 용해 시약(Lysis Reagents) 별매품입니다. 당사의 RNA-direct ^® Realtime PCR Master Mix [ Code No. QRT-101, QRT-201 ], THUNDERBIRD ^® Probe One-step qRT-PCR Kit [ Code No. QRZ-101 ]등의 1-step qPCR 시약을 사용할 수 있습니다.

●Culture Cell에서 Lysate만으로 RNA 추출 없이 간편하게 cDNA를 합성할 수 있습니다. Lysis Solution으로 처리한 Lysate에서 바로 cDNA 합성을 진행 하여 실험 시간을 대폭 단축할 수 있습니다.

●Lysate로부터 고품질의 cDNA를 합성을 하기 위한 최적화된 buffer로, RNase등으로 인한 RNA의 분해를 효과적으로 억제합니다(Lysate는 ice에서 최대 6시간까지 보관 가능합니다). 또한 gDNA Remover (DNase I) 처리 후에 cDNA 합성을 실시함으로써 gDNA의 오염이 적은 고품질의 cDNA를 합성할 수 있습니다.
cDNA 합성 시약은 당사의 고효율 역전사효소 「ReverTra Ace ^® 」으로 최적화된 마스터 믹스※가 되어 있어 간편・고효율로 cDNA 합성을 실시할 수 있습니다. 합성한 cDNA는 장기 보관 가능합니다.
※마스터 믹스에는 Random primer와 Oligo dT primer가 최적 비율로 혼합되어 있습니다.

● 다양한 포유류 세포 가능
SuperPrep ^® II는 효과적인 Cell Lysis와 RNase의 영향을 줄임으로써 이전 버전에 다양한 세포에 사용할 수 있습니다. 아래 표에서는 테스트 된 다양한 cell을 확인 할 수 있습니다.

● High throughput screening에 특화되어 있으며, 프로토콜에 gDNA remover와 RNase inhibitor가 포함되어 있어 추가적인 실험단계와 시간을 단축시켰습니다.

● THUNDERBIRD ^® Next SYBR™ qPCR Mix [ Code No. QPX-201 ]를 비롯하여 SYBR™ Green I, TaqMan ^® TOYOBO의 모든 qPCR 시약과 조합 가능하며 고효율의 결과를 얻을 수 있습니다.

1. 정제 된 RNA와 세포 용해 추출물에서 Ct의 상관 관계 검증

SuperPrep ^® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR을 사용하여 HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) 2.5x10 ⁴ 세포를 Lysis 후 cDNA 합성 (40 μL)을 수행했습니다. 동시에 HUVEC에서 추출한 Total RNA66.6ng에서 ReverTra ^Ace® qPCR RT Master Mix [ Code No. FSQ-201 ]를 사용하여 cDNA 합성 (40μL)을 실시했습니다. 각각의 cDNA를 THUNDERBIRD ^® SYBR™ qPCR Mix [ Code No. QPS-201 ]를 이용하여 15 종류의 House Keeping Gene 에 대해 qPCR 를 수행 후 비교했습니다.
그 결과, 15종류의 유전자에 있어서, 정제 RNA와 세포 용해 추출물을 사용한 결과에 양호한 상관이 인정되었습니다.

2. 세포 용해 추출물의 안정성 확인

SuperPrep ^® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR을 사용하여 HeLa S3 세포 4x10 ⁴ 세포에서 세포 lysate를 준비하고 얼음에 0-6 시간 후에 세포 lysate를 즉시 cDNA 합성을 수행합니다. 마찬가지로 이전 제품인 (SuperPrep ^® ) [ Code No. SCQ-101 ] 및 A사 시약을 이용하여 세포 lysate를 각각 cDNA 합성을 진행했습니다. 이 cDNA로 THUNDERBIRD ^® Probe qPCR Mix [ Code No. QPS-101 ]를 이용하여 GAPDH 유전자로 qPCR을 수행하였습니다.
그 결과 HeLa S3 세포에서 얼음에 6 시간 보관했을 때 현저한 Ct 값 차이가 관찰되지 않았다.

실시 예 3 : 편차를 고려한 분석 정확도 평가

실시 예 4 : 다양한 qPCR 시약과의 조합에 의한 성능 비교

<제품 사용 문헌>
K. Katsuya et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 509: 700-706 (2019)
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.12.164