QuantAccuracy ^® , RT-RamDA ^® cDNA Synthesis Kit는 RT-RamDA ^® cDNA Synthesis Kit [ Code No. RMD-201 ] 의 개량판으로, Single Cell, 극소량의 RNA 로부터 cDNA 를 합성할 수 있습니다. 본 키트에서 합성한 고효율의 cDNA는 qPCR에서 우수한 효율의 결과를 얻을 수 있습니다.

본 키트에서는 Reverse Transcription with Random Displacement Amplification(RT-RamDA ^® )법( 하향 참고문헌 )을 채용하고 있습니다. RT- ^RamDA® 법은 역전사효소의 가닥 치환 활성을 이용한 새로운 cDNA 증폭 방법으로, 극소량의 RNA로부터 poly(A) RNA, non-poly(A) 유래의 cDNA의 고효율 합성이 가능합니다 . 이 때문에 RT-RamDA ^® 에서는 이전 기술 보다 검출 유전자가 많은 것이 특징입니다.

● Single Cell이나 극소량의 RNA에서 cDNA 합성이 가능
1~500 single cell 또는 10pg~10ng total RNA에서 cDNA 합성이 가능합니다.

● 검출이 어려운 유전자에서도 합성 가능
고효율의 cDNA 증폭이 가능하기 때문에 검출이 어려운 유전자에서도 합성이 가능합니다.
예를 들어, degradation 된 FFPE 샘플의 RNA에서도, 증폭율의 low bias가 적게  가능했습니다.

● 소량의 RNA 샘플로도 cDNA를 합성할 수 있기 때문에 사용하는 RNA량을 줄임으로써 샘플을 절약해 해석할 수 있습니다.

RT-RamDA ^® 는 국립 연구개발법인리화학연구소 생명기능과학연구센터 바이오인포매틱스 연구개발팀이 개발한 「Reverse Transcription with Random Displacement Amplification」의 약자입니다.
역전사효소의 가닥 치환 활성을 이용한 새로운 cDNA 증폭 방법이며, poly(A) RNA 뿐만이 아니라, non-poly(A) 유래의 cDNA 합성이 가능합니다. cDNA가 합성과 동시에 증폭되기 때문에, 이전에 사용하고 있는 증폭용 어댑터나 PCR이 불필요하기 때문에, 증폭에 의한 바이어스를 억제하는 것이 가능합니다.


※RT- ^RamDA® 는 국립 연구개발법인리화학연구소의 등록상표입니다.

1. IL8 ( CXCL8 ) 유전자의 단일 셀 분석

HeLa S3 세포에서, 처리 없음(Control) 또는 100nM Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)로 24시간 처리(100nM PMA) 후, 셀 분류기를 이용하여 1 cell 씩 분리하고, PMA 처리에 의한 염증 성 사이토 카인 유전자 IL-8 ( CXCL8 )의 단일 세포 발현 분석 실험을 수행했다. 분취한 1세포(n=48)로부터 본 제품에 의해 cDNA를 합성하고, THUNDERBIRD ^® SYBR™ qPCR Mix [ Code No. QPS-201 ]을 이용하여 IL-8 ( CXCL8) 유전자의 정량을 실시했습니다.

그 결과 PMA 처리에 의해 Ct값이 3정도 작아지고 있어 IL-8의 발현량이 유의하게 증대하고 있는 것을 알 수 있었다. (p값은 Student의 t검정에서 산출했습니다). 이와 같이 본 제품을 사용함으로써, Single Cell 레벨에서도 유전자의 발현이 가능했습니다.

2. 극소량 RNA로부터의 cDNA 합성

만성 백혈병의 원인 유전자로 되는 유전자에 대해서, 1ng, 5ng, 10ng의 HeLa 세포 유래 RNA( BCR-ABL (-)) 중에 K562 세포 유래 RNA( BCR-ABL (+))를 10pg 스파이크하여, 본 제품 와 증폭능이 없는 A사, B사 역전사 시약으로 cDNA 합성을 실시하고, THUNDERBIRD ^® SYBR™ qPCR Mix [ Code No. QPS-201 ] 를 이용하여 BCR-ABL 유전자를 실시간 PCR로 검출했습니다 (n =4에서 실시).

HeLa 세포 유래의 RNA의 혼입률이 증가함에 따라, 증폭능이 없는 역전사 시약에서는 목적으로 하는 미량 RNA로부터의 cDNA 합성 효율이 낮은 결과가 나왔지만, 본 제품에서는 효율적으로 cDNA 합성을 할 수 있었고 모두 확인 가능했습니다.

실시예 3: 검출 유전자 수의 비교
실시예 4: FFPE 샘플로부터의 RNA로부터의 증폭
실시예 5: 증폭능이 없는 역전사 시약과의 성능 비교

Hayashi, T. et al., Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications . 9 :619(2018)
https://doi.org/10.1038/s41467-018-02866-0