본 제품은 (독) 산업기술종합연구소 오미야 선생님의 그룹과의 공동연구에 의해 개발된 브라질산 히카리코메츠키무시 유래의 루시퍼라제를 이용한 리포터 어세이 시스템에 대응하는, 피검 서열 삽입용 플라스미드 입니다. 용도에 따라 스탠다드 타입의 pELuc-test [ELV-101]과 Short life 타입의 pELuc(PEST)-test [ELV-201], 2 타입의 벡터를 준비하고 있습니다.

● 살아있는 세포에서 높은 발광

반딧불이 루시퍼 라제와 비교하여 살아있는 세포에서 높은 발광을 나타냅니다. 세포 배양액에 D-루시페린을 첨가하여 생세포에서 발광을 측정할 수 있습니다. 현재 주목 받고 있는 발광 이미징의 프로브로서 최적입니다.

●동적인 변동 해석이 가능

【Emerald Luc -Short life 타입-】 시계 유전자의 리듬 해석 등의 동적 변동 해석용으로는, 루시퍼라제의 C 말단에 분해 촉진 신호(PEST 서열)를 부가한 Emerald Luc -Short life 타입-을 사용하는 것이 수 있습니다. (특허 취득 완료)

● 높은 발광 안정성

Emerald Luc는 반딧불이 루시퍼 라제에 비해 파괴 계측에서 높은 발광 안정성을 나타내므로 발광 감쇠가 적고 HTS 분석에 최적입니다.

1. 반딧불이 루시퍼 라제와 살아있는 세포주에서의 성능 비교

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pELuc-test, pELuc (PEST)-test 및 반딧불이 루시퍼 라제 (fLuc)의 각 루시퍼 라제 유전자 상류에 AP1 반응 요소, HSVtk 프로모터를 삽입 한 구조물을 96 웰 플레이트에 파종 한 HeLa S3 세포에 형질 감염시켰다. 그 후, 이 세포를 PMA 또는 EGF, 및 0.2 mM 루시페린을 포함하는 배양액으로 치환하여 5시간 인큐베이션하고, 그대로 플레이트 리더로 발광을 계측하였다. 그림(상)은 시그널 계측치를,(아래)는 각 컨스트럭트마다 유도비(무첨가를 1로서 비율을 산출)를 플롯한 것입니다. Emerald Luc (ELuc)를 사용하면 반딧불이 루시퍼 라제와 비교하여 약 15 배의 신호가 관찰되었으며 유도 검출도 반딧불이 루시퍼 라제 (fLuc)에 비해 양호했습니다.

2.일반 시계 유전자의 전사 변동 해석

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pELuc-test, pELuc(PEST)-test의 루시퍼라제 유전자 상류에 개일변동성의 보고되고 있는 Bmal1 유전자 프로모터를 삽입한 플라스미드를, NIH-3T3 세포에 형질감염시켰다. 그 후, 세포를 100nM 덱사메타손으로 처리하고, 0.2mM D-루시페린을 함유하는 배지로 치환한 후, 배양하면서 연속 발광 측정 장치로 3일간 발광을 측정하였다. 그 결과, Emerald Luc -Short life 타입 - 쪽이 양호한 리듬 변동을 나타내는 것을 확인할 수 있었습니다. 이것은 세포 내 리포터 단백질의 수명이 단축되었기 때문이라고 생각됩니다. (*산업 기술 종합 연구소 나카지마 요시히로 선생님과 협력해 주셨습니다.)

3. NFκB 리포터를 이용한 단일 셀 이미징

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35mm 접시에 HeLa 세포를 시딩하고 (NFκB) 6-tk-ELuc (PEST) 플라스미드를 형질 감염시켰다. 다음날 10ng/mL TNFα, 0.5mM D-luciferin을 첨가하여 발광 이미징을 실시했습니다. 발광 이미징은 발광 이미징 시스템 LV200(올림푸스사)을 사용하여 노광: 2분간, 인터벌: 10분간, 배율: 20배로, 20시간 실시했습니다. 그 결과, TNFα 첨가에 의한 NFκB의 활성화 상태는 세포 집단에서 평가한 경우도 개별 세포 수준에서 평가한 경우에도 마찬가지로 TNFα 첨가 9시간 전후까지 활성화가 진행되고, 그 후 감쇠해 간다 일을 확인할 수있었습니다.