본 키트는 RT-RamDA ^® (Reverse Transcription with Random Displacement Amplification)법을 채용한 제품입니다. RT-RamDA ^® 법은 역전사효소의 사슬 치환 활성을 이용한 신규 cDNA 증폭 방법이며, poly(A) RNA 뿐만이 아니라, non-poly(A) 유래의 cDNA의 고감도의 검출이 가능합니다. 이 때문에 RT-RamDA ^® 법에서는 종래 기술에 비해 검출 유전자가 많은 것이 특징입니다.


GenNext ^® RamDA-seq ^® Single Cell Kit [Code No. RMD-101, RMD-101T]는 단일 셀과 미량의 RNA로부터 NGS 분석용 cDNA를 합성하기 위한 키트입니다. 본 키트를 사용하여 RNA 전체 길이를 커버한 해석을 위한 cDNA를 합성할 수 있습니다.
(라이브러리 준비에는 본 제품 외에 자성 비드 Agencourt AMPure XP 시약(Beckman Coulter사) 및 라이브러리 준비 시약 Nextera® ^XT DNA Sample Preparation Kit(일루미나사)가 필요합니다.)
RT-RamDA ^® cDNA Synthesis Kit [Code No. RMD-201, RMD-201T]는 단일 셀과 미량의 RNA로부터 실시간 PCR 분석용 cDNA를 합성하기 위한 키트입니다. 본 키트에서 합성한 cDNA는 고감도로 유전자 발현 해석을 할 수 있습니다.

●싱글 셀이나 미량 RNA에 대응

1~100세포 또는 10pg~1ng total RNA로부터 cDNA의 합성이 가능합니다.

RNA 전장을 커버하는 cDNA의 합성이 가능

Oligo-dT primer만을 이용하는 종래법에서는 어려웠던 10kb 이상의 타겟 RNA로부터 cDNA의 합성이 가능하고, RNA 전장으로부터 시퀀스 리드를 얻을 수 있습니다.

Poly(A) RNA 이외에 non-poly(A) RNA의 검출이 가능

Oligo-dT primer 이외에 NSR(Not so random primer)을 사용하고 있어 종래법에서는 검출할 수 없었던 non-poly(A) RNA의 검출도 가능합니다.

● 검출 유전자수가 업

히스톤 RNA, IncRNA, pre-mRNA, circRNA 등을 포함한 다양한 RNA의 검출이 가능합니다.

RamDA-seq ^® (람다섹)은 국립 R&D 법인 이화학 연구소 생명기능과학연구센터 바이오인포매틱스 R&D팀이 개발한 「Random Displacement Amplification Sequencing」의 약자입니다.
기존의 1세포 RNA 분석법에서는 Oligo-dT primer만을 이용하여 역전사하기 때문에 non-poly(A) RNA는 합성할 수 없고, 도중에 cDNA 합성이 멈추면 전장의 검출이 곤란하고 했다. 한편, RamDA-seq ^® 법에서는, random primer 혹은 NSR primer ^* 를 사용하기 때문에, poly(A) 서열 이외로부터도 합성이 가능하고, non-poly(A) RNA를 검출할 수 있습니다. 또한 이러한 primer가 RNA의 여러 위치에 결합하여 cDNA 합성이 시작되기 때문에 RNA 전체 길이로부터 서열 리드를 얻을 수 있습니다.
또한 RamDA-seq ^® 법은 cDNA가 합성과 동시에 증폭되기 때문에, 종래법으로 실시하고 있는 증폭용 어댑터 부가나 PCR이 필요 없고, 증폭에 의한 바이어스를 억제하는 것이 가능합니다.

* NSR primer은 Not so random primer의 약자로, 18S, 28S RNA 유전자에 완전히 매치하는 서열을 계산상 제외한 random primer입니다. random primer 대신 NSR primer을 사용하면 rRNA의 cDNA 합성을 억제 할 수 있습니다.

인간용, 마우스용 NSR primer을 준비하고 있습니다. 인간 유래 샘플에는 NSR Primer Set for human [Code No. NSR-101]을, 마우스 유래 샘플에는 NSR Primer Set for mouse [Code No. NSR-102]를 사용하는 것이 좋습니다.



※RamDA- ^seq® 와 RT- ^RamDA® 는 국립 연구개발법인리화학연구소의 등록상표입니다.

1. cDNA 증폭률 검증

기존의 역전사 반응 시약 및 RT- ^RamDA® cDNA Synthesis Kit를 사용하여 NIH3T3 total RNA 10pg에서 cDNA를 합성하고, THUNDERBIRD® ^SYBR ™ qPCR Mix [ Code No. QPS-201 ]에서 실시간 PCR을 실시하여 각 유전자 를 측정했습니다.
그 결과, 기존의 역전사 반응 시약으로 얻은 cDNA량에 대해 RT- ^RamDA® cDNA Synthesis Kit에서는 9배 이상의 cDNA를 얻을 수 있었습니다.

2. 입력 RNA 양의 검증

10pg 및 1ng의 NIH3T3 total RNA를 사용하여 RT- ^RamDA® cDNA Synthesis Kit에서 cDNA를 합성하고 실시간 PCR에 의해 8 유전자 (N = 3)
에서 실시)의 Ct 값을 비교했습니다. 그 결과 10pg
인풋과 1ng 인풋에서 높은 상관이 인정되어 미량의 인풋 양에서도 cDNA 합성이 가능했습니다.

3. 커버리지의 균일성 확인

mES total RNA 10pg 부터 GenNext ^® RamDA-
seq ^® Single Cell Kit에서 cDNA, 이중 가닥 DNA
를 합성하여 차세대 시퀀서 해석을 실시했습니다.
분석에는 ^{illumina® MiSeq®} 를 사용했습니다. 그 결과, 준비된 라이브러리가 대체로 유전자 전체를 균일하게 커버하고 있는 것을 확인할 수 있었습니다.

실시 예 4 : 장쇄 RNA에서 cDNA 합성의 비교
실시예 5: 검출 전사 산물 수의 비교 및 RNA 종류별 리드수의 검증
실시예 6: 랜덤 프라이머 및 NSR 프라이머를 사용한 경우의 rRNA 오염률 비교
실시예 7: 미량 RNA로부터의 cDNA 합성
실시예 8: 2nd쇄 합성 후의 정제 공정을 생략한 싱글 셀 해석용 라이브러리 조제법

Hayashi, T. et al., Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications . 9 :619(2018)
https://doi.org/10.1038/s41467-018-02866-0

<제품 사용 문헌>
Yoshimatsu, S. et al., Non-viral Induction of Transgene-free iPSCs from Somatic Fibroblasts of Multiple Mammalian Species. Stem Cell Reports , Volume 16:754-770(2021)
https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2021.03.002

Hasegawa, N. et al., Highly sensitive fusion detection using plasma cell-free RNA in non-small-cell lung cancers. Cancer Sci . 112 (10):4393-4403(2021)
https://doi.org/10.1111/cas.15084